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    本發明提供了一種可作為硼中子捕獲治療肝癌之硼藥物，其為硼酸水溶液。
    公开号:TW201315483A
    申请号:TW100136365
    申请日:2011-10-06
    公开日:2013-04-16
    发明作者:Fong-In Chou；Sy-Yu Lin；hong-ming Liu；Jinn-Jer Peir；Hsiao-Ping Chung
    申请人:Nat Univ Tsing Hua；
    IPC主号:A61K41-00
    专利说明:
    硼酸於硼中子捕獲治療肝癌之用途
    本發明係關於一種硼中子捕獲治療肝癌之硼藥物，尤其有關一種使用硼酸作為硼中子捕獲治療肝癌之硼藥物的新用途。
    硼中子捕獲治療肝癌應該是一種非常有價值的治療方法，但它至少需具有下列優點：非侵入性、沒有化療的副作用、對正常肝細胞幾乎沒有不利的影響、及病人復原快，但先前技術因未能選取得適合之含硼藥物，所以仍無法達到上述之需求。
    硼中子捕獲治療癌病在本發明以前多選擇使用腫瘤硼濃度與正常組織硼濃度比(T/N)高(越高越好)的硼藥物，使硼中子捕獲治療時僅癌細胞被選擇性殺死。目前被用於人類臨床硼中子捕獲治療癌症的藥物有BPA(Boronophenylalanine)及BSH(Borocaptate sodium)。
    BSH為水溶性之含硼藥物，為FDA認可用於BNCT臨床治療的含硼藥物。BSH用於Glioma患者BNCT臨床治療，當血腦障壁(Blood brain barrier,BBB)正常運作時，BSH無法穿越血腦障壁，但患有腦瘤之患者其血腦障壁遭到腫瘤破壞而不完整時，BSH便可穿越血腦障壁，進入與腫瘤細胞作用。
    BPA亦為FDA認可用於BNCT臨床治療的含硼藥物，為水溶性之藥物，其為苯基丙胺酸(Phenylalanine)的類似物。雖然，因腫瘤細胞膜上之胺基酸轉運體的表現與正常細胞有所差異，腫瘤細胞對BPA之吸收優先於正常細胞。但是，根據之前動物實驗顯示施予BPA硼藥物後，鄰近肝臟之胰臟有更高濃度之硼積聚[F. I. Chou,H. P. Chung,H. M. Liu,C. W. Chi,and W. Y. Lui,"Suitability of boron carriers for BNCT: accumulation of boron in malignant and normal liver cells after treatment with BPA,BSH and BA,"Applied Radiation and Isotopes vol. 67,pp. 105-108,2009.]，因此在進行中子照射時，當肝腫瘤獲得足夠之治療劑量時，胰臟將因中子捕獲反應而受到更嚴重之傷害。因此，臨床上以BPA為含硼藥物於肝腫瘤BNCT治療時，需於病人注射BPA後以手術取下病人之肝臟，進行肝腫瘤BNCT之離體中子照射，罹患腫瘤之肝臟無法於體內接受中子照射。但是，以離體之方式進行中子照射具有其限制及風險，包含醫師之移植技術、病患之生理狀態以及全程之無菌技術。在2007年，Suzuki等人進行了第一例原發型肝癌BNCT治療，此次則經肝動脈注射將BPA及BSH先行送入肝臟中後再以lipiodol混合BSH進行栓塞，此方法大大降低了BNCT治療過程之風險，但此次治療並沒有成功的將肝癌治癒，病人最終因為肝癌的再復發於BNCT治療後10個月因肝衰竭而亡。
    硼酸(Boric acid,BA)，分子式為H3BO3，分子量為61.83g/mol，在生理性PH值下為不帶電性之小分子，其分子體積(Molecular volume)為71.5，分子量甚至較尿酸小(75.3)，自然界之硼原子溶於水後多以硼酸之形式存在，為一弱酸性，而硼酸之B-O鍵為相當穩定之鍵結，故硼酸於生物體內幾乎不進行代謝，且因硼酸廣泛地用於日常生活中，常用作於殺蟲劑、除草劑以及防腐劑，因此利用口服途徑給藥，在人體、大鼠、家兔之生物毒性已有許多研究。在生物體中，硼酸會隨體液快速地被動運輸擴散至全身及細胞內，在早期含硼藥物於腫瘤及正常組織積聚之研究上，硼酸常做為參考化合物，且以往研究皆顯示硼酸於細胞中之積聚效率為1；在細胞培養之研究中，顯示硼酸在GS-9L、U-343MGa、HeLa、V79及B16細胞中分布均勻[J. A. Coderrea and G. M. Morrisb,"The radiation biology of boron neutron capture therapy,"Radiation Research,vol. 151,pp. 1-18,1999.]、[J. Capala,M. S. Makar,and J. A. Coderre,"Accumulation of boron in malignant and normal cells incubated in vitro with boronophenylalanine,mercaptoborane or boric acid,"Radiation Research,vol. 146,pp. 554-60,1996.]。
    經含硼藥物(Sulfhydryl borane dimer)處理後之荷腫瘤大鼠，以快速γ光譜術(Prompt-γ spectrometry)分析動物血液中之硼含量時，是以硼酸做為內控制(Internal control)[D. D. Joel,R. G. Fairchild,J. A. Laissue,S. K. Saraf,J. A. Kalef-Ezra,and D. N. Slatkin,"Boron neutron capture therapy of intracerebral rat gliosarcomas,"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,vol. 87,pp. 9808-9812,1990.]。
    使用電穿孔(Electroporation)方法增進含硼藥物(10B-BSH)進入腫瘤細胞之研究上，以硼酸為參考做比對，顯示10B-硼酸是自由進出細胞，10B在細胞內與培養液中之濃度是相同的，在細胞內無積聚作用。
    依硼中子捕獲治療(BNCT)之原理，傳統上，含硼藥物在腫瘤與正常組織中積聚之硼含量比需大於2.5至3以上[R. F. Barth,J. A. Coderre,M. G. a. H.Vicente,and T. Blue,"Boron neutron capture therapy of cancer curremt and future,"Clinical cancer research,vol. 11,pp. 3987-4002,2005.]，方能使BNCT治療有效殺死腫瘤細胞，而正常組織之傷害降至可接受之範圍。因硼酸是以單純擴散(simple diffusion)或稱為被動擴散(passive diffusion)的方式進出細胞，不具選擇性積聚之特性，即細胞內、外之硼濃度比約為1。硼酸於生物體之軟組織中無特殊積聚結果，未能達到BNCT治療中含硼藥物需於腫瘤中特別積聚之要件，故硼酸在BNCT研究上多做為內控制(Internal reference)，以測試含硼藥物之於生物体內分佈特性，或於硼濃度之分析時用為內標準(Internal standard)，至今仍未曾以硼酸作為含硼藥物進行BNCT治療。
    本發明的一主要目的在提供一種可作為硼中子捕獲治療肝癌之新穎硼藥物。
    本發明的另一目的在提供一種以硼中子捕獲治療肝癌之方法。
    為了達成上述本發明目的一種依本發明內容所完成的可作為硼中子捕獲治療肝癌之新穎硼藥物為硼酸。
    依本發明內容所完成的一種硼中子捕獲治療一對象的肝癌的方法包含將硼酸施用於該對象作為該硼中子捕獲治療的單一的含硼藥物。
    較佳的，該藥物為水溶液。更佳的，該藥物為靜脈注射水溶液。
    較佳的，構成該硼酸的硼具有一主要部份，更佳的約99%，為10B同位素。
    較佳的，該對象為人類。
    較佳的，該藥物的劑量為每公斤人類體重5-60 mg的10B同位素。目前研究顯示，硼酸以注射方式施藥對人體無顯著毒性的濃度是每公斤人類體重60 mg的10B同位素。因此，該藥物的劑量為每公斤人類體重不超過60 mg的10B同位素以避免對人體產生顯著毒性。
    較佳的，當該藥物被靜脈注射後進行硼中子捕獲治療的有效時間為10-120分鐘，以30-80分鐘為更佳。
    較佳的，該硼中子捕獲治療的物理劑量為5-12 Gy，以7-10 Gy為更佳。
    本發明方法進一步包含測量該對象的血中的硼濃度，並依據該硼濃度決定對該對象的肝癌進行中子照射。
    本發明出乎意料地發現10B-硼酸水溶液被用作為硼中子捕獲治療肝癌的單一硼藥物時可選擇性的殺死肝癌細胞。 意外的發現：
    10B-硼酸在軟組織中不具有特異積聚性，亦即施予10B-硼酸後生物體內各軟組織之含硼(10B)濃度相似[F. I. Chou,H. P. Chung,H. M. Liu,C. W. Chi,and W. Y. Lui,"Suitability of boron carriers for BNCT: accumulation of boron in malignant and normal liver cells after treatment with BPA,BSH and BA,"Applied Radiation and Isotopes vol. 67,pp. 105-108,2009.]，在癌細胞與鄰近正常細胞內之含硼濃度也應相似。本案發明人在以荷肝腫瘤之大鼠注射10B-硼酸水溶液進行BNCT治療時出乎意料的發現該大鼠之肝腫瘤完全消失，且鄰近之胰臟及脾臟等器官在組織病理切片上未見輻射傷害。 突出的功效增進：
    當以FDA核可之10B-BPA作為硼藥物進行BNCT頭頸部癌的治療時，必須先以18F-BPA正子電腦斷層造影(PET)進行評估，以了解腫瘤內之硼濃度與鄰近腫瘤正常器官之硼濃度之積聚比值。易言之，若有類似於10B-BPA的硼藥物(高T/N比)被開發用於肝癌之硼中子捕獲治療時，將不能免除以放射性元素(如18F)標示含硼藥物及PET造影評估硼藥物T/N比的步驟。在本發明中以硼酸水溶液作為硼藥物進行BNCT肝癌的治療時，不需要以放射性元素對硼藥物進行標示也不需要利用PET造影進行評估。此乃因為硼酸於生物各軟組織中不具有特異性積聚，病人血液中之硼濃度即約為肝腫瘤之硼濃度，因此於進行中子照射前無需先行以PET估算血液(或正常組織)與腫瘤中之硼濃度比。雖然不欲限制於下列理論，本案發明人推測硼酸可作為硼中子捕獲治療肝癌之有效硼藥物的原因，乃為肝臟的正常血管結構完整，而肝腫瘤的血管管壁較不完整、結構異常，導致兩者在經BNCT處理後受傷之程度不一。由都卜勒(Doppler)超音波檢測，顯示硼中子捕獲治療後，供應肝腫瘤之血管分佈逐漸減少乃至消失，腫瘤周圍之血流有明顯抑制。本發明只需要以靜脈注射方式將硼酸施用於病人，並於注射後之10-120分鐘(有效時間)內進行適當劑量之硼中子捕獲治療，即能選擇性的殺死肝腫瘤細胞。相反地，以10B-BPA作為硼藥物進行硼中子捕獲治療肝癌時，需以肝動脈導管注射、栓塞方式進行BSH及BPA兩種含硼藥物合併施藥。
    本發明將透過以下實驗被進一步了解，該等實驗僅用於示範說明上本發明，而非唯一用於本發明範圍。 實驗材料與方法一、硼藥物的製備及硼濃度測定
    在本發明中所使用於BNCT肝癌治療之含硼藥物為硼酸。 硼酸(Boric Acid,BA)水溶液配製
    硼酸化學式為H3BO3，分子量為61.83，於本實驗中所使用之硼酸所含之硼原子有99%為10B，1%則為11B(Sigma-Aldrich Co. LLC)。硼酸水溶液可依所需之10B濃度加適當之硼酸粉末於二次水中，以得到預定硼濃度之硼酸水溶液。 硼濃度測定
    樣品於硼含量分析前需進行微波消化，先將組織樣品放入鐵氟龍高壓消化瓶中，接著加入3 mL之濃硝酸(14 N,65%)及0.5mL之過氧化氫(30-35%)，將瓶蓋拴緊後放入微波消化系統(Microwave digestion system,MLS 1200 Milestone,Italia)進行消化。共分兩階段分解，第一階段設定300W，3分鐘，第二階段則設定為600W，2分鐘。最後進行冷卻減壓20分鐘。樣品需完全消化呈現澄清，樣品以二次水稀釋後，利用ICP-AES(OPTIMA 2000 DV,Perkin Elmer Instruments)測定硼含量。分析條件之氬電漿加熱溫度為6000-7000K，設定分析波長為249.773 nm，液體吸入速率約為2 mL/min，電漿形成後之操作電壓為40V。 二、肝腫瘤之動物模式建立
    以SD大鼠建立肝腫瘤動物模式，進行硼中子捕獲治療肝癌之動物實驗。 細胞株之培養
    所使用之腫瘤細胞株為N1-S1細胞，為雄性SD大鼠的肝腫瘤細胞株，其BCRC編號為60267。
    N1-S1細胞株培養於IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium;GIBCO)培養基，配置方法為取IMDM粉末及碳酸氫鈉(Sodium bicarbonate,NaHCO3)倒入血清瓶中，並加入適量二次水，經充分攪拌後再加入2mM L-麩胺醯胺(L-glutamine)和1%之青黴素-鏈黴素抗生素混合液(PS,100U/mL penicillin,100μg/mL streptomycin)，接著利用鹽酸(HCl)及氫氧化鈉(NaOH)調整溶液之PH值至7.2-7.3間。加入10%胎牛血清(FBS,fetal bovine serum)經0.2μM過濾膜過濾之。培養基置於4℃冰箱內保存備用。N1-S1細胞株置於5% CO2、37℃的培養箱內培養。當N1-S1細胞株密度達1.5x106個細胞/mL時便需進行繼代培養。細胞可直接連同培養基一起吸起，加入新鮮培養基後稀釋分裝至新的培養瓶(flask)內，亦可離心(1000 rpm，5分鐘)後捨去上清液，再加入新鮮之培養基進行分裝。於細胞培養、繼代期間，每星期約更換2-3次培養基。 腫瘤接種
    雄性的Sprague-Dawley(SD)大鼠為本次肝腫瘤動物模型所使用的動物，購入後飼養於動物房內觀察一周後進行實驗，動物房內溫度保持22℃，相對濕度保持於30-70%，並提供12小時光照/12小時黑暗光照周期之規律環境，動物飲食皆採取無限供應，唯記錄其飲食變化。
    腫瘤細胞的接種：SD大鼠於麻醉前皮下注射0.1 mg/kg bw的阿托平(Atropine)，抑制施打麻藥所造成之呼吸道及唾液腺分泌症狀，防止心臟受到迷走神經興奮所造成之心跳徐緩。待施打阿托平後10-15分鐘，經腹腔注射20-40 mg/kg bw的Zolital 50及10 mg/kg bw的Xylazine進行麻醉及鎮靜。待麻醉後利用劍禿下剖腹手術進行腫瘤接種。大鼠於手術預定區域進行除毛、75%酒精及優碘進行消毒後，沿腹中線剪開約3公分之開口，提起肌肉層做一小於皮層之開口，輕壓大鼠腹部兩側，使肝臟自然顯露。以29 G針筒將事先準備好之N1-S1腫瘤細胞懸浮液緩慢注入到肝葉中，每隻注射6 X 106 cell/0.1 mL。接種完畢後，以可吸收線縫合腹膜，再以尼龍線進行皮層縫合，將大鼠放回飼育籠，持續觀察大鼠活動及存活狀況。 超音波肝腫瘤影像掃描
    以商用超音波(TOSHIBA Xario)進行肝腫瘤掃描，採用解析度較佳之線性探頭(linear Probe)(PLT-1204BT)，頻率設定為14 MHZ。實驗中動物經麻醉後藉由B-mode超音波影像確認腫瘤的誘發率及生長狀況，正常之肝臟約在皮下2公分以內。實驗動物於BNCT治療前及治療後之第10、30、60及80天分別截取矢狀切面及橫切面兩種切面估算腫瘤之大小並利用都卜勒模式(Doppler mode)結合3D立體影像評估腫瘤內血管的分佈以及腫瘤於腹腔內的相對位置。 三、含硼藥物之藥物動力學及體內之硼分佈測定藥物動力學分析
    以硼酸水溶液為含硼藥物進行動物試驗，經由大鼠之尾靜脈(i.v.)給藥，施予硼酸藥物劑量為25 mg 10B/kg bw。動物於打藥前及打藥後之適當時間抽取血樣，檢測其血中硼濃度，以瞭解硼藥物之藥物動力學變化。血液存放於肝素管，血液樣品與等量2.5% Triton X-100(界面活性劑)混合均勻，再利用1%硝酸稀釋，即可以感應耦合電漿原子發射光譜儀(ICP-AES,Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)測定硼含量。
    硼酸水溶液經一次性靜脈注射(One-shot injection)後，經適當時間抽取適量血樣，檢測其血中硼濃度之變化，將濃度與時間做圖並用二腔室模型描述，亦即利用雙指數公式C(t)=Ae-αt+Be-βt做趨勢線以瞭解硼藥物之藥物動力學變化。使用WinNonlin(version 5.3,Pharsight,Mountain View,CA.)程式算出其中之參數，其中之參數包括藥物於中央腔室之濃度(A)，藥物在組織中之濃度(B)，藥物之分佈半衰期(Alpha-HL)，藥物之排除半衰期(Beta-HL)，血中藥物達最高之濃度(Cmax)，血中藥物濃度對時間做圖之曲線下面積(AUC)，藥物於體內分佈達穩定狀態時之分佈體積(Vss)，藥物由中央腔室排除之半衰期(K10-HL)，平均滯留時間(MRT)以及藥物之整體清除率(CL)。 含硼藥物之體內分佈測定
    硼酸水溶液經尾靜脈給藥，並於給藥後半小時、1、2及4小時分別將荷肝腫瘤之大鼠犧牲，此時腫瘤直徑約為1-1.5公分，採其腫瘤中心、腫瘤邊緣、腫瘤葉上之正常肝組織、正常肝葉之肝組織、肺臟、腎臟、心臟、小腸、胰臟、脾臟、胃、睪丸、和肌肉組織，置於-20℃冷凍備用於後續之組織硼濃度分析。 組織之硼濃度測定
    組織樣品於硼含量分析前需進行消化，消化前須先秤重，所取之樣品重量需大於0.2克，於0.5克時為較適。如上述方法微波消化。確認溶液呈現澄清即達完全消化，將溶液取出以二次水稀釋後，再以ICP-AES測定硼含量。 四、硼中子捕獲治療(BNCT)治療肝腫瘤動物中子照射固定器之設計與劑量模擬計算
    為適於其腹部照射，肝腫瘤動物中子照射模式之準直儀(Collimator)設計成具兩個直徑為2 cm之對稱圓形凹槽，可同時照射兩隻大鼠。接著利用MCNP(Monte Carlo N-Particle)程式將已經過驗證之射源檔模擬算出中子由射束出口經過不同材料與厚度後，到達生物體內之通率與品質，以得到最佳化之照射條件。其中組合材料包含聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、以及PE準直儀填入用於屏蔽正常組織之材料Li2CO3，各材料及鼠體之組成成分參數則參考NIST(National institute of standards and technonlogy)之材料分析報告以及ICRU(International Commission on Radiation Units & Measurements)46號報告，各器官之體積及位置則根據真實器官的尺寸以數學式訂定。最後利用模擬，計算照射時間。此外，利用各組織之硼濃度及中子之相對輻射生物效應(RBE)與傳統放射治療時正常器官之劑量限值比較，即可估算出各器官之最大容許劑量。以腫瘤鄰近正常組織之最大容許劑量作為腫瘤之處方劑量，於給定處方劑量後，進而估算所需照射之中子通量。 建立肝腫瘤動物中子照射模式
    實驗動物分為3組，正常組(即為正常之大鼠)、腫瘤對照組(即為大鼠僅接受腫瘤細胞接種，但不接受BNCT治療)以及BNCT治療組，BNCT治療組則再做照射不同物理劑量之分組。
    將接種N1-S1腫瘤細胞之大鼠於接種後第17天時進行BNCT治療，參考上述大鼠施藥後之實驗結果，取硼酸於體內及腫瘤中藥物之最佳代謝分佈時間點進行BNCT照射。利用氣體麻醉令大鼠暫時麻醉，接著靜脈注射硼酸水溶液25 mg 10B/kg bw。大鼠於照射前15分鐘施打阿托平以及Zoletail，使老鼠進入較長期之麻醉。老鼠置於固定架上並將腫瘤部位貼近清華水池式反應器射束出口，於特定的中子通量率下進行不同時間之中子照射，以獲得特定之照射劑量。照射後，利用清華大學反應器之中子即時線上偵測系統(on-line neutron monitoring system)確認實際照射劑量。 五、BNCT療效評估超音波檢查
    腫瘤是利用商用超音波(TOSHIBA Xario)進行掃描，頻率設為14 MHZ。正常肝臟約在皮下2公分以內。以超音波影像追蹤經BNCT處理後80天內，腫瘤消長及腫瘤周圍血管之變化。藉由2D mode超音波影像確認腫瘤狀況，截取矢狀切面及橫切面兩種切面估算腫瘤之大小並利用都卜勒模式結合3D立體影像評估腫瘤及其周邊之血管的分佈。 血清生化值之測定
    於腫瘤接種前、後每週利用尾靜脈抽血，監控大鼠之血清生化值，犧牲時，亦利用心臟採血取得血液。採集全血裝入血清分離管(Vacationer,Franklin Lakes,NJ,USA)，以3000 rpm離心15分鐘，取血清上清液冷凍保存後，委託國立中興大學獸醫教學醫院測其血清生化值，以血清生化儀(Chiron Diagnostics Corporation,Oberlin,OH,USA)分析肝及腎功能相關之血清酵素之含量。 統計分析
    資料數據以平均值±標準差(mean±standard deviation)表示，並以Student t-test計算是否具有統計意義，並定義P值小於0.05代表具有統計意義。 結果一、硼酸水溶液之生物體內分佈藥物血液動力學
    經尾靜脈注射硼酸水溶液(25 mg B/kg bw)至荷肝腫瘤之老鼠。於注射後第5、10、20、30、40、60、120、180、240及360分鐘，由尾靜脈抽取血液分析血液中之硼含量。圖1為硼酸水溶液注射後不同時間之血液中硼濃度變化。
    荷肝腫瘤SD大鼠，經靜脈注入25 mgB/kg bw的硼酸水溶液後，利用semi-log做圖取得平均血中硼濃度與時間之關係。資料數據利用二腔室公式C(t)=Ae-at+Be-βt做趨勢線[J. A. Jansen,J. Andersen,and J. S. Schou,"Boric acid single dose pharmacokinetics after intravenous administration to man,"Archives of Toxicology,vol. 55,pp. 64-67,1984.]。此藥物動力學之曲線可分為兩個部分，一為注射後20分鐘內之陡降區以及其後之緩降區。硼酸水溶液由雙指數曲線進行代謝，將兩區域分為快速分佈相與緩慢排除相。
    血液中初始硼濃度為104.6±36.23 μg/mL，約20分內快速降至27.84±8.09 μg/mL，而後則呈現平穩下降，注射360分鐘後約降為8.3±2.57 μg/mL。Alpha-半衰期(a-HL)和Beta-半衰期(β-HL)為232.13±100.59分鐘與3.59±1.64分鐘。表1為硼酸水溶液經靜脈一次性注射之血液動力學各項參數平均值。
    血中硼藥物濃度對時間做圖之曲線下面積(AUC)為9756.30±2433.34 min*ppm。由此可算出藥物由中央腔室排除之半衰期(K10-HL)為68.04±31.8分鐘，而藥物由中央腔室至組織之移動速率常數(K12)為0.16±0.09分鐘，藥物由組織至中央腔室之移動速率常數(K21)則為06±0.02分鐘。另外，硼酸之藥物整體清除率(CL)為0.01±0.01 L/min平均滯留時間(MRT)則為288.09±108.13min。 藥物於鼠體內之生物分佈
    荷腫瘤之大鼠由尾靜脈注入25 mg B/kg bw之硼酸水溶液，在注射後30分鐘及1、2、4小時後犧牲動物，取腫瘤及正常肝、肺臟、心臟、脾臟、胰臟、腎臟、胃、腸、睪丸及肌肉、血液等組織，分析存留於各器官及組織內之硼濃度。腫瘤處又分為腫瘤邊緣及腫瘤內部兩區域。
    硼酸經靜脈注射後2小時間內，肝腫瘤中之硼濃度高於正常肝細胞，且肝腫瘤周邊組織所含之硼濃度較其中心亦具有稍高之硼濃度聚集，其差異性約為20%。於注射後4小時，其腫瘤與正常肝細胞中之硼濃度已不見明顯差異。
    經不同施藥時間後所測得之腫瘤與正常組織之硼濃度如表2所示，硼酸水溶液注射後30分鐘，腫瘤與正常肝臟、心臟、肺臟、胰臟以及胃等器官相比，硼濃度比約可達1.2。除了腎臟外，其他正常組織中之硼含量皆低於或等於腫瘤組織內之硼濃度，除了睪丸及肌肉外，軟組織中的硼濃度在注射後30分鐘時達到最高濃度後便會緩慢下降，肌肉則會在注射後一小時達到最大值，睪丸之硼濃度則於打藥後2小時內呈漸漸累積，隨注射後時間的拉長而上升，但於打藥後4小時可見其已下降。
    雖硼酸水溶液於軟組織中並無特異聚集之性質，但注射後仍可發現腫瘤區域之硼濃度有微高於其他器官之現象。打藥後0.5、1、2及4小時腫瘤中之平均硼含量為25.54±4.12、20.75±1.76、18.86±3.72以及10.72±1.64 mg B/kg，肝臟含硼量為22.18±3.53、18.97±0.79、17.76±3.93及10.56±1.23 mg B/kg，血液中濃度則為23.83±2.96、19.83±1.48、17.98±2.77及12.57±3.47 mg B/kg。 二、擺位及各器官所接受之物理劑量
    中子照射前，由尾靜脈注射25 mg B/kg之硼酸水溶液至荷肝腫瘤之大鼠體內，打藥後30分鐘，將兩隻大鼠置於設計好之準直儀(Collimator)後方，並將肝腫瘤瞄準於準直儀上之洞口，以1.5 MW功率下進行不同時間照射，令大鼠接受不同劑量，照射前先以MCNP code計算額定之物理劑量，照射結束後並利用即時中子束監測系統校正實際照射劑量。
    在治療前，利用MCNP code計算肝腫瘤附近之器官，危急器官包含肝臟、脊椎中段、腸道、腎臟以及睪丸。BNCT治療組之各組劑量依各器官對所接受之物理劑量做比較，分為G1、G2、G3共3組劑量，G1組之腫瘤將接受之劑量為11.2 Gy，G2為8 Gy，G3為5.6 Gy，其劑量組成如表3。
    三、以硼酸水溶液做硼中子捕獲肝癌治療硼藥物之療效評估
    SD大鼠飼養一周以適應環境後，接著利用開腹手術進行腫瘤細胞注射，手術後老鼠體重可見略微下降但經休養1-2日後便呈穩定上升。腫瘤注射後17日，利用超音波檢查腫瘤之大小，次日並於原子爐進行BNCT照射。 老鼠體重變化
    此實驗分為正常組，為未經處理之正常之大鼠；腫瘤對照組，為大鼠僅接受腫瘤細胞接種，但不接受BNCT治療；及3種劑量之BNCT治療組。接受BNCT治療之大鼠在3-10天中可見體重較治療前明顯下降。但各組體重降至最低點之時間不同，G1組降至最低點為BNCT照射後8天，體重為原先之78%，G2組為照射後4天，體重降為原先之89%，G3組為照射後第3天，體重為原先之92%。此外老鼠並有輕微之腹瀉以及食慾較差之狀況，接受較低劑量組別大鼠之體重恢復較快，BNCT治療各組別之老鼠體重在降至最低點後便逐漸上升。但於BNCT治療後約15天(等同腫瘤細胞注入後32天)，可見未經BNCT治療之荷肝腫瘤大鼠體重則上升較緩慢，並於腫瘤接種後約50天後有體重下降之狀況。圖2為各組老鼠之體重變化圖，此結果顯示，照射後所造成體重下降之現象僅為短暫、可恢復之副作用。 腫瘤大小變化
    以超音波掃瞄檢查大鼠腫瘤之大小變化。G1至G3三組於BNCT治療後11天之腫瘤與治療前之腫瘤大小比較皆已變小，且其變小程度相似。至BNCT治療後一個月，三組之腫瘤體積皆小於或等於原先體積之22%(最小者可達原先體積之6%)，BNCT治療後一個月之腫瘤體積與BNCT治療後兩個月之腫瘤體積變化趨緩，持續追蹤至BNCT治療後的80天未見腫瘤有再增長或復發之現象發生。而腫瘤對照組之腫瘤體積已較原體積增加1.34倍。
    表4為大鼠接受BNCT治療前至治療後一個月之腫瘤縮小比率，荷肝腫瘤之大鼠經超音波檢查後，將腫瘤大小以比例表示之。腫瘤比例之計算公式如下[M. Feng Wu,PhD,M. Zhi-Biao Wang,PhD,M. Wen-Zhi Chen,M. Jian-Zhong Zou,M. Jin Bai,M. Hui Zhu,M. Ke-Quan Li,M. Cheng-Bing Jin,M. Fang-Lin Xie,and M.Hai-Bing Su,"Advanced hepatocellular carcinoma-treatment with high-intensity focused ultrasound ablation combined with transcatheter arterial embolization,"Radiology vol. 235,pp. 659-667,2005.]：
    式中A和B為BNCT治療前矢狀切面與橫切面掃描面上之長軸，A'和B'則為BNCT治療後之矢狀切面與橫狀切面上之長軸。以零代表初始狀態，負值代表腫瘤變大，正值代表腫瘤縮小，以1為終點，即為腫瘤完全消失。 腫瘤血流分佈
    在此實驗中，超音波用於腫瘤接受BNCT治療後之血流偵測。3D都卜勒影像顯示此肝腫瘤為一血管豐富之腫瘤。在此實驗中，我們利用彩色都卜勒超音波影像比較腫瘤的血流灌注狀態，時間點分別為BNCT治療前1天，治療後8、12、18天的血流灌注狀態。由3種劑量之BNCT治療組G1、G2和G3的都卜勒影像中可見經BNCT治療後，腫瘤周圍之血流分佈逐漸減少直到無法測得，尤以治療後第8天時，觀察到血流分佈減少最為明顯，爾後腫瘤周圍的血管分佈仍有減少，但減少之幅度不如第8天時所顯現。但是，腫瘤區域血流減少的效率與其所接受BNCT治療的劑量之相關性並不明顯，推測此三組劑量皆已對血管造成無法修復之傷害。雖然腫瘤周圍之血流有明顯的抑制，但腫瘤下方之腹主動脈血流並不受影響，也因此推測對於腫瘤外較大之血管，給與本次劑量後並無產生明顯之傷害，其原因可能與腫瘤和正常肝臟血管的組織結構不同有關。另由對照組的都卜勒影像中可見其腫瘤周圍之血流分佈隨時間增加逐漸增加。 血清生化值分析
    在BNCT治療肝腫瘤前及BNCT治療完後，皆利用血清生化值檢測做為追蹤，追蹤之項目包含GOT、GPT及BUN。表5列出各組別大鼠GOT、GPT及BUN於BNCT治療前及治療後之變化，由表中可見不同組別之異同。
    在腫瘤細胞注射前，所有組別之血清生化值皆落於正常值之範圍。在本實驗中，肝臟酵素GOT在腫瘤細胞注入後有明顯的上升，但經BNCT治療後，3種劑量之BNCT治療組G1、G2和G3皆快速下降。GPT在腫瘤細胞注入後亦有上升，不過隨著BNCT治療後亦回到了正常值。在本實驗中，利用監測BUN的變化以瞭解BNCT治療後動物體的泌尿功能，正常組及BNCT照射組在BNCT治療後一個月皆不見有意義之變化，但在腫瘤對照組，於腫瘤細胞注射後47天後可見BUN上升。不過此BUN數值上升時，鼠體並伴隨著後肢癱瘓及腎臟腫大，因此推測BUN之上升可能與腫瘤過大而壓迫神經及膀胱有關。
    組織病理切片變化BNCT治療後4天
    在低倍數下觀察，可見腫瘤對照組之腫瘤細胞較經BNCT治療後之腫瘤細胞排列緊密，經BNCT治療後之腫瘤細胞排列則較為鬆散，而兩者之正常肝細胞則不見差異。由高倍數下則可發現經BNCT治療之腫瘤細胞有萎縮變小、空洞化、裂解、壞死等消退之病變，且腫瘤中之血管附近亦可見纖維和結締組織填補。 BNCT治療後30天
    於BNCT治療組中，各組間並未發現明顯差異，於肉眼病變下，腫瘤已成為一小白點，於切片下亦無找到明顯差異，因此於BNCT治療後30天之病理切片探討中並不對BNCT治療組各組分別描述。經BNCT治療後，肝腫瘤獨立於肝左葉，皆不見漫延至其他肝葉，可見腫瘤明顯變小，外觀僅見一小白點。於腫瘤病理切片圖中則可見小白點內部有獨立、中度纖維化並伴有鈣化填充，此外亦可見單核球(主要為巨噬細胞)浸潤，細胞內並含有許多空泡，於切片中亦並無發現存活腫瘤細胞。此外，亦可於肝臟中發現纖維化填充並含有血鐵素，這些症狀代表肝臟組織正處於修復(Repair)的狀態。
    腫瘤對照組之腫瘤則可見變大，有絲分裂旺盛，細胞型態並呈多形性(Pleomorphic)，可見正常之肝細胞受到腫瘤的擠壓。 BNCT治療後80天
    BNCT治療後80天，於BNCT治療組中，各組間並無發現有所差異，於肉眼下觀看，已無法於肝腫瘤表面判斷病灶位置(但於超音波掃瞄下仍可顯現肝臟內部有一高回音性之小點)，因此於BNCT治療後80天之病理切片探討中不對BNCT治療組各組分別描述。圖3的上方示出治療後80天治療組的三個肝臟外觀照片，及圖3的下方示出對照組在同時間的三個肝臟的外觀照片。從圖3的上方照片中可見治療組的肝臟表面上已無明顯之病灶。而從圖3的下方照片中可見對照組的肝臟的右邊肝葉上有大於1公分的腫瘤團塊。圖4A為大鼠經BNCT治療後80天之病理切片圖，從其中可見超音波掃瞄所示之小點內除有中度纖維化外並伴有鈣粒子填充，但於切片中並無發現存活之腫瘤細胞。圖4B為腫瘤對照組之病理切片圖，仍可見一大的腫瘤團塊，圖4B中左邊為肝腫瘤區域，右邊則為正常肝細胞區域。 四、BNCT治療肝腫瘤後一個月之器官輻射損傷
    於腫瘤BNCT照射後4天，病理切片檢查中並無發現睪丸異常，但於BNCT照射後一個月，不論以肉眼直接觀察或組織學檢查睪丸皆有明顯之病變。圖5即呈現睪丸(Testis)於BNCT照射後一個月之輻射效應。圖中可見睪丸中之曲細精管(Seminiferous tubule)有明顯萎縮，萎縮程度與接受之劑量高低具有相關性，但間質細胞並未受影響。由圖5A可見G1組之睪丸萎縮程度遠比圖5B之G3組嚴重，此外，由圖5中亦可發現睪丸內之各細精管之受傷程度各不相同。
    由於大鼠於BNCT治療時採用的準直儀具有相對地較大的口徑，而使得大鼠的睪丸受到中子照射。此缺點於人體臨床實驗將可以藉由採用具有適當口徑大小的準直儀，及因為人體體積相對地較大，睪丸與肝臟相距較遠，所受劑量較小而獲解決。
    本發明以硼酸水溶液作為BNCT肝癌治療之含硼藥物，簡單、有效治癒肝腫瘤。大鼠經硼酸水溶液施藥後進行中子照射，於照射後第10天，各組照射劑量者於超音波影像顯示腫瘤之大小皆顯著的減小，其腫瘤邊緣之增生血管分佈亦有明顯的減少。於照射完30天腫瘤之大小減少約90%，殘留之纖維化小塊經病理切片檢查，其中已無腫瘤細胞存在。經BNCT照射完的第80天，犧牲動物，觀察肝臟表面發現已不見腫瘤痕跡。僅肝腫瘤所接受之劑量為11.2 Gy組之睪丸細胞有較明顯萎縮。本發明證實硼酸水溶液可做為硼中子捕獲治療之單一含硼藥物有效治癒肝癌。
    圖1大鼠注射硼酸水溶注射後不同時間之血液中硼濃度變化，其中趨勢線之公式為C(t)=Ae-at+Be-βt。
    圖2荷肝腫瘤大鼠經BNCT照射後，各組老鼠之體重變化圖。
    圖3的上方為大鼠經BNCT治療後80天之肝臟外觀照片；圖3中的下方為未經治療之對照組大鼠的肝臟外觀照片。
    圖4大鼠經BNCT治療後80天之病理切片圖，其中(A)為肝腫瘤經BNCT治療後之病理切片圖，圖中可見高度纖維化(箭頭圍繞之區域)外並伴有粗糙之鈣粒子填充(箭號處)，但於切片下並無發現存活之腫瘤細胞；(B)為腫瘤未經BNCT治療之對照組之病理切片圖，圖中左邊為肝腫瘤區域，由圖中可見腫瘤因生長過於快速，離血管較遠處之腫瘤細胞部分呈現壞死，但養分充足區域則仍舊可見腫瘤細胞生長活躍，右邊則為正常肝細胞區域。
    圖5大鼠肝腫瘤經BNCT治療後一個月之睪丸(Testis)輻射效應，其中(A)為治療組G1之睪丸型態，可見睪丸萎縮嚴重；(B)為治療組G3之睪丸型態，可見睪丸內各細精管之受傷程度亦不相同，程度亦較G1組之睪丸輕。
    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種使用硼酸於製備用於硼中子捕獲治療一對象的肝癌的藥物的用途。
    [2] 如申請專利範圍第1項的用途，其中該藥物為水溶液。
    [3] 如申請專利範圍第2項的用途，其中該藥物為靜脈注射水溶液。
    [4] 如申請專利範圍第1項的用途，其中構成該硼酸的硼具有一主要部份為10B同位素。
    [5] 如申請專利範圍第1項的用途，其中構成該硼酸的硼的約99%為10B同位素。
    [6] 如申請專利範圍第3項的用途，其中該對象為人類。
    [7] 如申請專利範圍第6項的用途，其中該藥物的劑量為每公斤人類體重5-60 mg的10B同位素。
    [8] 如申請專利範圍第3項的用途，其中當該藥物被靜脈注射後進行硼中子捕獲治療的有效時間為10-120分鐘。
    [9] 如申請專利範圍第8項的用途，其中當該藥物被靜脈注射後進行硼中子捕獲治療的有效時間為30-80分鐘。
    [10] 如申請專利範圍第1項的用途，其中該硼中子捕獲治療的物理劑量為5-12 Gy。
    [11] 如申請專利範圍第10項的用途，其中該硼中子捕獲治療的物理劑量為7-10 Gy。
    [12] 如申請專利範圍第1項的用途，其中該藥物被靜脈注射後進行硼中子捕獲治療的時間係該對象的血中的硼濃度而決定。
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